在上期中，我们共同研究了同源重组法在生物医疗领域中构建质粒的实验步骤。那么在实验过程中有哪些关键注意事项呢？让我们一起来探讨一下吧！

同源重组法质粒构建中的注意事项

(1) 引物设计：同源臂的长度通常在15-20bp之间，GC含量应维持在40%-60%之间。计算引物的Tm值时，只需考虑特异性引物部分，不包括同源臂及酶切位点。若引物超出40bp，建议选择PAGE纯化以提升阳性克隆率。

(2) 模板选择：在PCR扩增目的片段时，若扩增困难，可先用不带同源臂的引物克隆目的片段，然后以胶回收产物为模板，使用带有同源臂的引物进行二次PCR。需要注意，此方式可能带来较多突变。

(3) 酶切与线性化：进行载体线性化时，务必确保酶切完全，可以通过延长酶切时间或采用双酶切方法实现。使用单酶切时，要小心未酶切完全的环状质粒残留可能影响转化效率。

(4) 片段纯化：在胶回收过程中，需使用全新刀片以避免外源DNA污染。同时，确保胶回收产物的质量和浓度，以便后续精确计算使用量。

(5) 比例与用量：务必按照最适摩尔比1:2计算与使用载体和插入片段的量，以提高重组效率。若未纯化的线性化克隆载体和扩增片段添加量应控制在反应体系体积的1/5以内。

(6) 重组反应条件：重组反应需在冰上配制反应体系，并轻轻混匀以避免振荡。反应时间温度要严格控制，一般为37℃反应30分钟，过短或过长的反应时间都可能影响克隆效率。

(7) 转化过程：感受态细胞在冰上解冻后加入重组产物，需轻轻混匀以免细胞损伤。热激时间和温度要控制准确，并迅速在热激后冷却。此外，转化产物的涂布量要适中，过多或过少都可能影响阳性克隆的筛选。

(8) 鉴定环节：在菌落PCR鉴定时，选择合适引物及PCR程序，确保结果准确。对于初步鉴定阳性的菌落，建议进行测序以确认重组质粒的正确性。

同源重组法质粒构建中的常见问题

1. 胶回收产物低，浓度不足：可以增加实验的起始量，因为大 większość胶回收试剂盒回收率仅为30%-60%。因此，在载体酶切和扩增片段时，建议使用200μl的跑胶体积。

2. 扩增的PCR产物无条带或条带弱：请检查引物的Tm值及GC比例，必要时可更换引物或优化PCR条件。

3. 涂板后无菌落或极少菌落：可能是由于线性化克隆载体或扩增片段使用量不足，建议使用双酶切法切割载体以防自连。

4. 菌液PCR无条带：可能是载体连接不成功或引物设计存在问题。

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