将动物机体的各种组织从机体中取出，并通过酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，使其分散为单细胞后，放入适合的培养基中进行培养，确保细胞的存活和繁殖，这一过程称为原代培养。原代细胞培养的步骤通常包括取材、分离和培养维持。本文重点讨论原代细胞的取材和分离方法。

一、细胞取材

成功的原代细胞培养首先依赖于细胞的取材，它直接影响细胞在体外的培养效果。取材的基本要求包括：新鲜度和保鲜性、严格的无菌操作、避免机械损伤、去除无用组织以防干燥、关注组织的类型、分化程度和年龄，最后要做好记录。

1. 取材技术

不同类型组织的取材方法如下：

• **皮肤和粘膜的取材**：通常来自手术中获取的皮片，操作类似外科取断层皮片，但面积一般为2~4平方厘米。
• **内脏和实体瘤的取材**：内脏基本是无菌的，需清楚所需组织的类型和部位；采集实体瘤时，应选择肿瘤细胞丰富区域，避免破溃和坏死部分，以减少污染。
• **血液细胞的取材**：血细胞和淋巴细胞可以从静脉外周血抽取，或从脾、扁桃体、胸腺及淋巴结等淋巴组织中提取，并需注意抗凝。
• **骨髓、羊水及胸/腹水细胞取材**：应严格无菌，注意抗凝，尽快分离培养，处理后使用无钙、镁的PBS洗涤。
• **鼠胚组织取材**：采用引颈或气管窒息法处死孕期鼠，消毒后取出处理，需注意避免酒精影响组织活力。
• **幼鼠胚肾或肺的取材**：死后消毒并固定，用无菌方法取材。
• **鸟类胚胎组织**：选择适当胚龄的胚蛋进行消毒、检测和取材，需严格遵循无菌程序。

二、原代细胞的分离

在获取细胞后，由于细胞间结合紧密，必须将组织充分散开以实现细胞的分离和培养。

1. 悬浮细胞的分离方法

对于来自血液、羊水等的悬液材料，最简单的办法是通过1000 r/min的低速离心，10分钟后可根据密度差异分层收获所需细胞。

2. 实体组织材料的分离方法

针对物理结合紧密的实体组织，可以采用机械和消化法进行细胞分散。具体方法如下：

• **机械分散法**：特点是快速简便，但对组织损伤较大，适用于软组织处理。
• **消化分离法**：剪切组织并使用酶的作用松动细胞间的桥连结构，随后采用机械方法使细胞充分分散。常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。

3. 消化分离法的操作步骤

主要步骤包括剪切、加液、漂洗、消化和机械分散。注意在消化前需漂洗组织块以去除抑制因素，并避免过高浓度的胰蛋白酶或过长的作用时间。

通过以上方法和步骤，能够有效提高原代细胞培养的成功率，为生物医学研究提供可靠的细胞基础。在进行细胞培养与分离时，若有需要，可以咨询俄罗斯专享会284的专业支持，以获取更多指导和资源。