IPS诱导肠类器官的培养过程分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、以及类器官的培养。本文将重点介绍第三个阶段——类器官培养，并详细阐述其原代操作步骤，时间范围为14至28天。

一、准备工作

在进行类器官培养之前，需要准备以下试剂和耗材：

• 人正常肠类器官培养试剂盒（型号：abs9545）
• 低因子、无酚红的基质胶（型号：abs9495）
• 15毫升离心管（型号：abs7102）
• 15毫升EP管若干（型号：abs7119）
• 24孔细胞培养板（型号：abs7035）
• 金属冰盒

具体组分及其规格如下：

• 类器官培养基 A: 100ml
• 类器官原代培养缓冲液 B: 250ml
• 类器官传代消化液 D: 30ml
• 组织保存液 E: 100ml
• 类器官冻存液 F: 20ml
• 类器官传代培养缓冲液 G: 250ml

二、操作流程

1. 加胶、点板及加液

整个原代操作的关键步骤包括：

1. 准备工作:
   • 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃的冰箱中融化过夜。
   • 枪头与离心管需在-20℃预冷至少30分钟。
   • 融化后的基质胶在4℃下保存，建议在两周内使用完毕。
2. 接种要求:

   在24孔培养板中，每孔添加25μl的基质胶和500-750μl的类器官培养基，建议的密度为1:1。

3. 加胶及点板:

   向细胞团沉淀中加入基质胶，轻轻吹打混匀（避免产生气泡），然后进行点板操作。整个过程中需在金属冰盒或冰上进行，以维持基质胶的流动性。

4. 加液:

   将铺好的培养板放入37℃的培养箱中40-60分钟，让基质胶成胶，接着添加500-750μl的类器官培养基进行培养。在大约10-14天内，类器官的直径可达200μm-500μm，可进行传代操作。

2. 传代操作

对于类器官数量较多或体积较大的情况，传代步骤包括以下几个环节：

1. 类器官收集及洗涤:
   • 使用移液器吸去培养基，向每孔加入1-2ml的4℃类器官传代培养缓冲液，轻柔吹散基质胶并收集在15ml离心管中。
   • 向离心管中加入类器官传代培养缓冲液，定容至14ml，静置在4℃中至少40分钟或在-20℃中放置5分钟以软化基质胶。
   • 进行离心，通常情况下会形成三层，需保留类器官沉淀。
2. 类器官消化:

   加入2-3ml的类器官传代消化液，在超净台内消化2-3分钟，结束消化后添加5倍体积的类器官传代培养缓冲液以终止消化。

3. 加胶、点板和加液:

   与之前相同的步骤，添加基质胶、进行点板，并加液进行培养，确保在合适的温度与时间条件下执行。

3. 冻存操作

在类器官的指数增长期进行冻存，最佳时间为传代后的第3至第4天，此时类器官直径通常在100μm-200μm。

1. 进行收集和洗涤，确保基质胶得到充分稀释。
2. 在离心后，根据规定的密度进行冻存处理，确保在低温环境中保护类器官的活性。
3. 完成冻存过程后，将类器官转入液氮罐以保留其活性。

关键注意事项

在整个操作过程中，需关注以下要点：

• 在操作基质胶时，应全程在冰上进行，以避免提前固化。
• 确保细胞在内胚层分化前达到85-90%的融合状态，以利于球状体的形成。
• 使用新鲜配制的生长因子，避免反复冻融造成的活性损失。
• 遵循无菌操作标准，定期检测细胞培养的无污染情况。

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